Oxid dusnatý (^.N=O)

Poznámky k přednášce Václava Hampla (komentáře a otázky e-mailem)

Diapozitivy jsou (v angličtině) tady (ale je v nich celkem to samé, jako na této stránce)

Proč separátní přednáška o NO?

• ještě před pár lety pouze nepříjemné a nebezpečné znečištění ovzduší přispívající ke smogu a kyselým dešťům,
  dnes nejstudovanější endogenní molekula posledních 10 let
• explozivní rozvoj znalostí (cca 300 nových publikací měsíčně)
• nové téma, starší učebnice insuficientní
• "Molekula roku" 1992 prestižního vědeckého časopisu Science
• účastní se funkce všech hlavních orgánových systémů
• během několika let postup od základního objevu k významným klinickým pokrokům (PPHN, ARDS, šok, impotence)

HISTORIE:

1620		NO prvně připraven belgičanem Janem Baptistou van Helmontem (t.j. dříve než třeba kyslík - 1774)
1772		chemicky charakterizován Josephem Priestleyem (objevitel kyslíku)
1800		toxicita (Sir Humphry Davy se málem zahubil, když to zkoušel dýchat)
1867		amylnitrit snižuje krevní tlak při hypertenzi (dnes víme, že to dělá tím, že uvolňuje NO)
1914-8		dělníci plnící za první světové války nitroglycerin do dělostřeleckých granátů měli velmi nízký krevní tlak, což vedlo k zavedení nitroglycerinových tablet pro úlevu při angině pectoris; dnes víme, že účinek amylnitritu i nitroglycerinu je zprostředkován oxidem dusnatým uvolňovaným z těchto látek
1977		NO aktivuje guanylát cyklázu a tak zvyšuje intracelulární koncentraci cGMP (Ferid Murad)
1980		objev endoteliálního relaxačního faktoru (EDRF, Robert Furchgott). Snaha identifikovat EDRF vedla bezprostředně k následujícímu objevu:
1987		schopnost eukaryotických buněk tvořit NO: Louis Ignarro, Salvador Moncada
1998		Nobelova cena za fysiologii a lékařství: Robert F. Furchgott, Louis J. Ignarro, Ferid Murad ("za klíčové objevy týkající se NO jako signální molekuly v kardiovaskulárním systému") (Moncada cenu nedostal, přestože to mnozí čekali) (Alfred Nobel vydělal na Nobelvy ceny tím, že vynalezl dynamit, založený na nitroglycerinu, sám trpěl ICHS, předepsali mu nitroglycerin, Nobel to považoval za ironické)

NĚCO MÁLO CHEMIE NO:

• NO je radikál (lichý počet valenčních elektronů, konkrétně 11 - o 1 víc než N₂, o 1 míň než O₂)
• to, že je to radikál, se někdy zdůrazňuje tečkou (^.NO), to ale není nutné, "radikálovost" je implicitní v označení NO
• z N₂ a O₂ se tvoří jen za specifických podmínek při vysokých teplotách, např. při blesku;
  taky vzniká ve spalovacích motorech a tepelných elektrárnách
• samovolně se nerozkládá, jen za vyššího tlaku - při něm pozvolna vzniká 2-3 % toxického NO₂ za měsíc (pozor na skladování v bombách!)
• poměrně málo rozpustný ve vodě (~1.7 mmol/l při 25^oC), t.j. řádově podobně jako O₂ či N₂
• v přítomnosti kyslíku podléhá autooxidaci za vzniku NO₂: 2 NO + O₂ --> 2 NO₂
• autooxidace je asi 200x rychlejší v roztoku než v plynné fázi
• autooxidace je rychlá (několik sec), je-li NO i O₂ hodně, ale celkem pomalá, je-li NO málo - jako je tomu většinou v tkáních, kde je NO méně než 10 uM (poločas NO tam může být až 500 sec)
• ve vodném roztoku jsou produktem autooxidace nitrity (NO₂^-), pouze v přítomnosti hemoproteinů proběhne oxidace až na nitráty (NO₃^-)
• v přítomnosti superoxidu (O₂^-, velmi reaktivní kyslíkový radikál tvořený v malém množství jako vedlejší produkt respiračního řetězce a ve velkém množství v místech zánětu-NADPH oxidáza) vzniká extrémně rychle peroxynitrit:
  NO + O₂^- --> ^-OONO
  ^-OONO není radikál, ale je velmi raktivní a cytotoxický
• NO je velmi rychle inaktivován oxidací s železem oxyhemoglobinu za vzniku NO₃^- (nitrosoHb --> metHb --> Hb reduktáza --> oxyHb)

NO SYNTÁZY (NOS)

• v savčích buňkách je NO tvořen pětielektronovou oxidací terminálního guanidino dusíku L-argininu molekulárním kyslíkem; kromě NO vzniká L-citrulin
  L-arg + O₂ --> NO + L-cit

• celou komplexní reakci katalyzuje jediný enzym (neobvyklé, čekali bychom sérii 2 enzymů), NO syntáza (NOS; EC 1.14.13.39), který existuje ve 3 isoformách
• všechny 3 isoformy NO syntázy:
  

  	-	obsahují v aktivním centru hem
  	-	jsou aktivní jako homodimery
  	-	jsou stereospecifické (D-arginin není substrátem)
  	-	jako kofaktory vyžadují: NADPH, 6(R)-5,6,7,8-tetrahydrobiopterin, FAD, FMN a kalmodulin (ten se k NOS typu I a III váže po navázání Ca na kalmodulin, NOS II váže kalmodulin trvale)

Doporučené označení	NOS I	NOS II	NOS III
Alternativní označení	nNOS (neuronální); ncNOS (neuronal constitutive); bNOS (brain=mozková)	iNOS (inducibilní); mNOS (makrofágová)	eNOS (endoteliální); ecNOS (endothelial constitutive)
Molekulová váha	~160 kDa	~130 kDa	~133 kDa
Gén na lidském chromosomu	12	17	7
Vyžaduje Ca2+	+	-	+
Lokalizace v buňce	cytosol	cytosol	buněčná mambrána (kaveoly)
Výskyt	některé centrální a periferní neurony, některé buňky epitelu a cévního hladkého svalu, kosterní sval; není v glii	makrofágy, glie, hepatocyty, endotel, epitel, srdeční myocyty, hladký sval,...	cévní endotel, plicní a renální epitel, trombocyty, srdeční myocyty, hipokampus
Exprese proteinu	konstitutivní (trvalá)	většinou inducibilní (pouze po stimulaci cytokiny apod.); někde snad konstitutivní (epitel dýchacích cest, nosní dutiny ?)	konstitutivní (trvalá); expresi moduluje mechanické namáhání endotelových buněk
Regulace aktivity	Ca2+, ser/tyr fosforylace, NO (zpětnovazební inhibice)	jakmile je protein exprimován, není aktivita regulována; NO (zpětnovazební inhibice)	Ca2+, ser/tyr fosforylace, modulace exprese
Hlavní (pato)fysiologický význam	neurotransmise, neuromodulace	boj s infekcí a tumory (cytotoxicita)	regulace cévního tonu, průtoku krve tkáněmi, krevního tlaku

ÚČINKY NO NA CÍLOVOU TKÁŇ

• při velkých množstvích obvykle převládá oxidace (O₂, O₂^-) za tvorby vysoce reaktivních, cytotoxických produktů (ONOO^-) - zabíjení i jinak obtížně zlikvidovatelných baktérií (např. Mycobacterium tuberculosis), hub, parasitů a tumorů, inhibice replikace virů
• v nižších koncentracích je oxidace pomalá, většinou převládá regulační působení prostřednictvím aktivace solubilní isoformy enzymu guanylát cyklázy (heterodimer obsahující hem, s kterým právě NO interaguje)
• aktivace guanylát cyklázy zvyšuje v cílové buňce koncentraci cyklického guanosin-3',5'-monofosfátu (cGMP), ten zprostředkuje účinky NO
• cGMP:
  

  	-	přímo řídí některé kanály (např. draslíkové kanály v sítnici)
  	-	moduluje fosfodiesterázy cAMP (enzymy, které inaktivují cAMP, což je druhý posel řady hormónů a neurotransmitterů) (např. destičky - zvýšení cAMP - synergie NO-PGI2)
  	-	snižuje intracelulární koncentraci Ca2+, hlavně prostřednictvím aktivace solubilní (typ I) isoformy cGMP-dependentní protein kinázy (homodimer)
  	-	v hladkém svalu přímo inhibuje kontraktilní aparát

• cGMP je inaktivován fosfodiesterázami cGMP (typu I., VI. [jen ve fotoreceptorech] a zejména V., patří mezi nejméně 7 fosfodiesteráz cyklických nukleotidů) na 5'-GMP
  (selektivním inhibitorem PDE V je třeba zaprinast - slibné pokusy s klinickým využitím; taky Viagra)

• Donory NO (nitroglycerin, nitroprusid, NOáty)
• Inhibitory NOS (L-NMMA, L-NAME, aminoguadinin, asymetrický dimethylarginin)
• Aktivátory eNOS (endotel-dependentní vazodilatancia)
• Inhibitory fosfodiesterázy (Zaprinast, Viagra [sildenafil],...)

---

FYSIOLOGIE NO

• Neurotransmitter (NANC, spíš difusní ovlivnění nějaké oblasti)
  • učení, paměť, spánek, bolest, deprese
    
  • retrográdní messenger (postsynaptická buňka potvrzuje presynaptické buňce příjem zprávy)
  • dlouhodobá potenciace (presynaptická buňka je programována, aby příště vyslala signál silnější - podklad paměti)
• Zabíjí viry, baktérie, parazity, tumory (iNOS; indukci inhibují kortokosteroidy)
• Inhibuje mitochondriální respiraci
• Nejvíc NO se dělá v nose a paranasálních dutinách
  • Pravděpodobně důležité pro jejich dezinfekci
  • NO lze dobře měřit ve vydechovaném vzduchu
  • Malá část vydechovaného NO pochází z dolních dýchacích cest (lze měřit odebíráním vzorků z úst) - mění se při některých nemocech, např. astma)

• Vazodilatace závislá na endotelu (ACh, CGRP,... - eNOS)

• Potencují to estrogeny (-> ženy před menopauzou nižší riziko infarktu než muži, po menopauze je doženou)
• Potencuje to inzulín (? více inzulínu -> větší nabídka glukózy tkáním díky většímu prokrvení ? - narušeno při inzulínové rezistenci)
• "Tonická" hladina

• Průtokem indukovaná vazodilatace (shear stress)
  • NO je v tomto nenahraditelný - porucha vede k hypertenzi
• Existují endogenní inhibitory NOS, např. ADMA (asymetrický dimethylarginin)
  • lidé, kteří ho mají hodně, mají zvýšené riziko atherosklerózy
• Vazodilatace kůže při oteplení (podstatné pro termoregulaci) (J. Appl. Physiol. 86: 1185-1190, 1999)
• Vzestup průtoku krve plícemi po narození
• Snižuje srážlivost krve
  • Inhibice adhese, agregace a sekrece trombocytů
  • Fylogeneticky staré - krabi před 500 milióny let (hodně dlouho před savci)
• Zprostředkuje zvýšení natriurézy/diurézy při zvýšení arteriálního tlaku
  • Mechanické namáhání endotelu renálních arteriol zvýšeným tlakem stimuluje syntézu NO, ten difunduje k tubulům a snižuje v nich reabsorbci Na (nNOS ?, eNOS ?)
    
• Erekce (= vazodilatace hladkého svalu kavernózních těles a jeho arteriol zprostředkovaná NO z terminál pánevních nervů - nNOS)

• Inhibuje apoptózu ("fysiologický" způsob smrti, opak proliferace, nepůsobí zánět jako někdy nekróza), tím, že inhibuje (prostřednictvím cGMP a G kinázy) apoptotické fosforylační signály a taky přímo inhibuje kaspázy (specifické proteázy apoptózy, které obsahují v aktivním místě cystein, ten může být oxidem dusnatým S-nitrosylován)
• Podíl na regulaci laktace ? (J. Pediatr. 131: 839-843, 1997)
• NO z endokardu moduluje srdeční kontraktilitu
• NO tlumí kontrakci kosterního svalu (News Physiol. Sci. 11: 114-119, 1996)

Když je něco z fysiologie špatně

Např. mozková mrtvice: tkáň má nedostatek O₂, snaží se vyvolat vazodilataci produkcí NO, ale nepomáhá to, tak se dělá pořád dál, až už je ho moc a začne působit toxicky na postiženou tkáň.

Nebo septický šok - infekce indukuje expresi iNOS a vysokou tvorbu NO, která má likvidovat infekci, ale působí i vazodilatačně na cévy - masivní pokles cévního odporu a tlaku krve.

Úloha v systémové hypertenzi není zatím zcela dořešená:

• eNOS -/- ("knock-out") myši mají hypertenzi, myši se zvýšenou expresí eNOS mají hypotenzi, nNOS-/- myši mají tlak normální (Nature 377: 239-242, 1995)
• Ale syntéza NO není snížená zdaleka ve všech experimentálních studiích hypertenze, v řadě studií je naopak zvýšená, zejména v počátečních stádiích
• NO v některých částech mozku výrazně moduluje sympatickou aktivitu, proto lokální inhibice NOS v mozku zvyšuje systémový tlak krve
• Zatím se spíš zdá, že dysfunkce NO není prvotní příčinou hypertenze; nicméně při hypertenzi může dojít k poklesu tvorby NO (poškození endotelu vysokým tlakem?), a to pak hypertenzi dále zhoršuje.
  (Vapaatalo et al - Role of endothelium and nitric oxide in experimental hypertension. Physiol. Res. 49: 1-10, 2000)

Plicní hypertenze: NO dysfunkce za ní primárně nemůže, ale těžká plicní hypertenze může poškodit endotel a snížit tvorbu NO, to pak plicní hypertenzi dále zhoršuje. (podrobněji)

Hypercholesterolémie poškozuje endotel-dependentní vazodilataci

(Am. J. Physiol. 275: H1482-H1488, 1998)

Endoteliální dysfunkce způsobená atherosklerotickým plátem - kromě jiného posléze pokles tvorby NO -> paradoxní kontrakce cévy v situaci, kdy se normálně dilatuje (koronární cévy při námaze - angina pectoris), snížená ochrana proti tvorbě trombů -> např. až infarkt

Záněty (revmatoidní arthritida)

Erektilní dysfunkce (viz Merck Manual)

NO V TERAPII

Inhalace plynného NO:

• PPHN - persistující plicní hypertenze novorozenců
• ARDS - syndrom dechové tísně dospělých

Erektilní dysfunkce - Viagra (inhibitor fosfodiesterázy cGMP)

Šok - pokusná terapie inhibitory NO syntázy (výsledky zatím nejednoznačné)

Oficiální webová stránka oxidu dusnatého

Podrobnější text o NO v plicní cirkulaci a hypertenzi nabízí moje habilitace.